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La ricerca di Legionella spp. mediante tecniche biomolecolari consiste nella diretta ricerca dell’acido nucleico (DNA) del microrganismo, sia da campione ambientale (acqua) che clinico (siero, BAL, aspirato bronchiale, urine). Elevatissima sensibilità e specificità (vicine al 100%) caratterizzano tali metodiche, che permettono di rintracciare la presenza del microrganismo in tempi rapidi, nettamente inferiori a quelli della metodica colturale classica.
Negli ultimi 15 anni sono state sviluppate diverse metodiche molecolari, basate sul principio della ibridazione in situ o della amplificazione dell’acido nucleico in PCR (reazione a catena della polimerasi). Quest’ultima si è rivelata la metodica in assoluto più sensibile.
La modalità di
esecuzione di un test biomolecolare prevede in genere 3 fasi:
-
Estrazione del DNA dal
campione (fase critica se il campione è ambientale, data la presenza di sostanze
che possono agire da inibitori nelle fasi successive) utilizzando kit o
metodiche convenzionali;
- Amplificazione mediante PCR in uno strumento chiamato termociclatore, usando nella reazione primers diretti o verso la sequenza dei geni per il 5S rRNA (genere specifici) o il 16S rRNA (specie specifico) o verso il mip (macrophage infectivity potentiator) di L. pneumophila;
- Visualizzazione del prodotto di PCR su gel di agarosio (step di rivelazione).
L'introduzione della metodica della real-time PCR ha permesso di ridurre ancora più i tempi di esecuzione del test (circa 2 ore), combinando la ricerca qualitativa del microrganismo (presenza-assenza) con quella quantitativa. La metodica prevede uno step di estrazione del DNA cui segue l’amplificazione in un termociclatore specifico per la rivelazione del segnale fluorescente emesso in fase di amplificazione. Nella real-time PCR, oltre alla classica coppia di primers specifici per il microrganismo da cercare, viene aggiunto al mix di reazione di PCR un “probe” fluorescente, che legandosi in un segmento di DNA compreso tra le estremità amplificate dai primers, permette di visualizzare il prodotto di amplificazione in tempo reale. Inoltre, avvenendo la fase di amplificazione e di rivelazione in un'unica provetta chiusa, ciò determina una minor possibilità di cross-contaminazione (quindi di falsi positivi) in fase di rivelazione.